Projeto de Primers para Reações de PCR

A determinação e escolha de um primer ou par de primers a ser utilizado em um experimento de PCR, ou baseado em PCR, requer uma série de cuidados quanto ao tamanho, composição, temperatura de pareamento (ou melting) e especificidade dos primers, entre outros. Não existem valores específicos pré-definidos para os parâmetros envolvidos no projeto de primers, contudo, intervalos de valores para esses parâmetros são de senso comum. Segue uma breve descrição dos parâmetros envolvidos no projeto de primers.

Repeats, Runs e Estruturas Secundárias

A ocorrência repetida de uma subsequência de nucleotídeos em posições consecutivas na sequência de um primer é chamada repeat. Repeats devem ser evitados uma vez que eles podem favorecer o pareamento entre o primer e o template em posições não desejadas (evento também chamado de misprimer, como mostrado na Figura 9). Runs são definidos como a repetição consecutiva de uma única base na sequência do primer.

Figura 9: Primer com repeats (ATC). Os matches ocorridos no pareamento entre o primer e o template são representados pelo símbolo "|", enquanto que os mismatches são representados por "*". [Figura retirada de Montera (2008)].

Se os primers forward (F) e reverse (R) (reveja a seção 1.2) apresentarem trechos complementares entres si, esses podem se parear, em detrimento do pareamento entre primer e o template, formando uma estrutura secundária chamada hetero-dimer. Caso o pareamento ocorra entre dois primers F ou dois primers R, ocorre a formação de uma estrutura secundária denominada self-dimer. Primers longos podem se auto-parear, resultando em estrutura secundárias denominadas hairpins.

Especificidade e Tamanho do Primer

Um primer é específico se ele se pareia com o template apenas na região específica para a qual ele foi projetado (ver região alvo da Figura 9). Primers não específicos acarretam na produção (amplificação) de fragmentos de DNA não correspondentes à região alvo.

O tamanho de um primer influencia a sua especificidade (primers maiores são mais específicos); custo de produção (quanto maior o primer, mais elevado é seu custo); estabilidade da formação template-primer (quanto maior o primer, mais fortemente ele estará unido ao template devido ao maior número de pontes de hidrogênio resultantes desta ligação); e formação de estruturas secundárias (primers maiores são mais propensos à formação de estruturas secundárias). Não existe um tamanho fixo ótimo para um primer. Primers variando entre 18 e 30 bases são os mais indicados (KAMEL; ABD-ELSALAM, 2003).

%CG e Extremidade 3'

O conteúdo de bases Citosina (C) e Guanina (G) de um primer determina a temperatura na qual a reação de pareamento deve ocorrer basicamente pelo fato do pareamento destas bases ocorrer devido à formação de três pontes de hidrogênio enquanto que o pareamento entre as bases A e T ocorre a formação de duas pontes de hidrogênio. Quanto maior o número de bases C e G, mais fortemente "ligados" estarão o primer e o template. Valores entre 40% e 60% de CG na composição dos primers são preferidos.

Preferencialmente, uma base C ou G deve compor a extremidade 3' de um primer por ser esta a extremidade na qual a enzima polimerase inicia a extensão do primer. Como o pareamento C--G é mais estável, espera-se que a polimerase inicie o processo de síntese mais eficientemente neste caso.

Temperatura de Pareamento

Cada uma das etapas da reação de PCR -- desnaturação, pareamaento e extensão (ver Figura 8) -- ocorrem sob temperaturas "ideais". A desnaturação, responsável por transformar a molécula de DNA de fita dupla em duas moléculas de fita simples ocorre por volta de 94°C. A temperatura de pareamento é dependente dos primers utilizados e a temperatura de extensão é dependente do tipo de enzima polimerase utilizada.

A temperatura de melting (T_m) é definida como a temperatura na qual metade dos fragmentos de DNA está na forma desnaturada, ou seja, não pareados, e a outra metade está pareada. A temperatura de pareamento ou annealing (T_a) é a temperatura na qual ocorre o pareamento entre primer e template. Tipicamente, a T_a difere de 3 a 5°C a menos da T_m dos primers.

Existem diversas maneiras de se calcular a T_m de um primer. De uma maneira geral, podemos classificar as fórmulas para o cálculo da T_m como:

• Básicas: consideram apenas a composição do primer;
• Dependentes do Sal: consideram a concentração de sal na reação onde pareamentos ocorrem;
• Baseadas na Termodinâmica da reação: utilizam-se do modelo \emph{Nearest Neighbor}.

O objetivo deste trabalho é fazer um levantamento das diferentes formulações para o cálculo da T_m bem como a implementaçção das mesmas a fim de comparar os resultados. Antes de apresentar a revisão bibliográfica sobre as formulações para o cálculo da T_m de primers (o que é feito no Capítulo 3), é necessário que conceitos de termodinâmica e do Modelo Nearest Neighbor sejam apresentados (Capítulo 2) já que diversas formulações para o cálculo da T_m se baseiam nestes conceitos.