Cálculo da Temperatura de Melting

Diferentes formulações são apresentadas para calcular a T_m de primers. Sendo essas formulações organizadas em três classes distintas: Básicas, Dependentes de Sal e Baseadas na Termodinâmica.

1 Básicas

Os cálculos básicos para o cálculo da T_m consideram apenas a composição do primer, ou seja, apenas a quantidade de cada base que compõe o primer. Marmur e Doty (1962) propuseram a seguinte fórmula para o cálculo da T_m :

(1) T_m = 64.9 + 41.0*(|G| + |C| - 16.4) / (|A| + |T| + |G| + |C|).

A fórmula sugerida por Wallace e colaboradores (1979) é:

(2) T_m = 2*(|A| + |T|) + 4*(|C| + |G|).

Ambas as equações (1) e (2) assumem que o pareamento ocorre em condições padrão de 50 nM de concentração de primers, 50mM de concentração de sal (Na⁺ ) e pH próximo de 7.0. Em ambas, |A|, |C|, |T| e |G| representam a quantidade de bases Adenina, Citosina, Timina e Guanina, respectivamente.

2 Dependentes de Sal

Formulações dependentes do sal consideram a concentração de sal no buffer da reação de PCR.

Howley e colaboradores (1979) apresentaram a seguinte fórmula para o cálculo da T_m:

(3) T_m = 100.5 + 41.0*(|G| + |C| - 16.4) / (|A| + |T| + |G| + |C|) - (820.0) / (|A| + |T| + |G| + |C|) + 16.6* log([Na⁺])

O termo 16.6* log([Na⁺]) ajusta a T_m para mudanças na concentração de sal.

3 Baseadas na Termodinâmica

As formulações para o cálculo da T_m que se baseiam no modelo NN consideram a composição da sequência do primer em termos das interações entre os pares de bases vizinhos definidas pelos valores de variação de entalpia e entropia.

SantaLucia e colaboradores (1996) descrevem a seguinte fórmula para o cálculo da T_m :

(4) T_m = [(ΔH + ΔH_iniciacao) / ( ΔS + ΔS_iniciacao + ΔS_simetria + R* ln(C/b))] + 16.6* log([Na⁺]).

onde ΔH e ΔS é a soma da variação da entalpia e da entropia, respectivimanete, sobre todos os pares de bases internos; ΔS_simetria é a penalidade da entropia por sequências autocomplementares , e ΔH_iniciacao e ΔS_iniciacao são as somas iniciais de variações entalpias e entropias, respectiviamente; R é a constante dos gáses (fixada em 1.987 cal/K*mol) e Cé a margem de concentração do primer na solução dada em mol. A constante b recebe o valor 4 para sequências não-autocomplementares ou valor a 1 para autocomplementares.

Rychilik e colaboradores (1990) propuseram a seguinte fórmula para o cálculo da T_m:

(5) T_m = [(ΔH) / (ΔS + R* ln(C/4))] - 273,15 + 16.6* log([Na⁺])

onde ΔH, ΔS, R e C são definidos como no parágrafo anterior.