Reação de PCR

O processo conhecido como síntese in vitro de DNA se refere à produção, em laboratório, de diversas cópias de uma molécula de DNA original. Em 1957 foi realizada a primeira síntese in vitro de DNA, por Arthur Kornberg, Uriel Littauer e sua equipe (LITTAUER; KORNBERG, 1957). A descoberta da enzima polimerase I isolada da bactéria Escherichia coli, viabilizou o desenvolvimento da técnica, uma vez que essa enzima atua na replicação do DNA.

Para que as enzimas do tipo polimerase atuem na replicação ou cópia de moléculas de DNA, é necessário a presença de três componentes básicos: primers, moldes e os quatro nucleotídeos (adenina (A), citosina (C), guanina (G) e timina (T)).

Primers são sequências iniciadoras do processo de síntese e correspondem a curtas cadeias de nucleotídeos complementares à região inicial (primer forward) e região final (primer reverse) da sequência que se deseja copiar, dita sequência alvo. Em uma mesma reação, primers e sequência alvo (a qual deve estar na forma desnaturada, ou seja, fita simples) se unem por complementaridade entre suas bases. Uma vez formado o complexo -- primer e sequência alvo -- as enzimas do tipo polimerase ligam-se ao grupo OH da extremidade do carbono C3' do primer (extremidade 3' OH) para dar início ao processo de síntese. Para que a nova molécula seja sintetizada, a DNA polimerase utiliza a sequência alvo como molde e, segundo o princípio da complementaridade entre as bases, adiciona novos nucleotídeos aos primers. Este processo recebe o nome de extensão. Ao final da extensão, uma nova molécula, complementar à sequência molde, é produzida. Este tipo de reação, quando realizada em laboratório, é denominado PCR (Polymerase Chain Reaction) ou Reação Polimerase em Cadeia. Devido a necessidade do grupo 3' OH livre na sequência do primer para que a enzima DNA polimerase se acople, tem-se que a síntese de uma nova molécula só ocorre no sentido 5' &rarr 3'. Caso o \textit{primer} pareie com a sequência de DNA molde de forma que o sentido de extensão necessário seja 3' → 5', a polimerase não atua e, portanto, a extensão não ocorre. O esquema de atuação de enzimas do tipo polimerase é representado na Figura 7.

Figura 7: Atuação da enzima DNA polimerase na replicação do DNA. (a) A polimerase é capaz de estender o Primer1 criando uma fita complementar ao molde. (b) A polimerase não é capaz de estender o Primer2 -- uma extensão não ocorre a partir da extremidade 5'. [Figura retirada de Montera (2008)].

O termo amplificação é utilizado para caracterizar experimentos com vistas ao aumento (em número) de uma molécula. A amplificação de uma molécula de DNA em laboratório ocorre por meio de diversos ciclos de extensão por polimerase. No primeiro ciclo, a molécula de DNA alvo é desnaturada (reveja a seção 1.1) resultando em duas sequências molde, as quais, após se parearem com os primers, servem como molde para extensão dos mesmos pela polimerase, resultando em duas novas moléculas de DNA idênticas à original. No segundo ciclo, as duas moléculas resultantes do ciclo anterior são desnaturadas, dando origem a quatro moldes que, após o pareamento com os primers e a extensão, dão origem a oito novas moléculas de DNA idênticas à molécula original. Assim, após um número n de ciclos de PCR (desnaturação, pareamento e extensão) tem-se, idealmente, 2ⁿ moléculas de DNA indênticas à molécula original. A Figura 8 ilustra as três etapas do ciclo de PCR.

Diversas variáveis e parâmetros, tais como o número de ciclos, a temperatura e o tempo de duração de cada ciclo, bem como a qualidade e a quantidade de primers utilizados podem interferir na reação de PCR e, consequentemente, o número 2ⁿ de sequências de DNA resultantes pode não ser obtido após a execução de n ciclos de PCR.

Figura 8: Ciclos de PCR com primers. A cada ciclo uma molécula de DNA dá origem a duas novas moléculas odênticas à molécula original. [Figura retirada de Montera (2008)].